预杂交
1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。
2）用等体积的HYB＋取代HYB－。
3）60℃水浴，原位杂交检测，预杂交4小时以上。
杂交
1）吸去预杂交的HYB＋，加上100ul已加入探针的HYB＋溶液（探针浓度约为1ng/ul）..
2）60℃ 温浴过夜。
注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。
DNA 探针为原位杂交提供较高的灵敏度。与RNA探针相比，DNA探针与靶mRNA 分子的杂交强度较弱，因此在杂交后的洗涤中不应使用甲醛。
探针特异性至关重要。如果已知细胞中mRNA或DNA的确切核苷酸序列，则可据此设计高度的互补探针。如果超过 5% 的碱基对不互补，那么探针只能与靶序列发生轻度杂交。这意味着，探针更容易在洗涤和检测步骤中被洗去，可能无法正确检测。
将32 P标记的双链DNA探针于100℃加热5分钟，荧光原位杂交技术，迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。
杂交结束后，原位杂交，去除杂交液，立即于室温把滤膜放入大体积（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中，轻轻振摇5分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗 一次，同时应避免膜干涸。
68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜两次，每次1-1.5小时。此时已可进行自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃将滤膜浸泡60分钟。
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