






种子消毒与接种选取饱满、无霉变、无破损的水稻成熟种子,人工脱壳去除颖壳。无菌超净台内操作:75%乙醇浸泡30 s,无菌水冲洗;再用2%次浸泡15–20 min,期间不断摇晃;无菌水冲洗3–5次,残留消毒液。吸干种子表面水分,均匀接种于诱导培养基。注意:消毒不极易大面积污染;消毒过度会灼伤种胚,导致无法诱导愈伤。
胚性愈伤挑选(重中之重)培养2周后开始观察,挑选色泽淡黄、颗粒致密、干燥饱满、不水渍、不褐化的胚性愈伤。舍弃松软发白、透明水渍、发黑褐化、长根长芽的非胚性愈伤。愈伤是转化成功的,劣质愈伤侵染后几乎全部或无法分化。
关键影响因素与优化要点1. 受体材料基因型基因型是制约玉米转化效率的因素,传统模式材料Hi-II玉米转化效率较高,但多数骨干育种自交系天然转化效率极低。通过形态调控基因辅助技术、培养基配方优化,可有效弱化基因型依赖性,适配主流育种材料。
农杆菌侵染条件农杆菌菌液OD值、侵染时间、共培养温度与湿度直接影响转化效果。菌液浓度过高易导致幼胚褐化,浓度过低则侵染效率不足;适配的负压、离心处理可显著提升T-DNA转移效率。
依托改造后的根癌农杆菌Ti质粒T-DNA转移系统,去除质粒致瘤基因,构建安全的二元载体、三元载体系统。将目的基因与筛选标记基因插入T-DNA区域,在农杆菌Vir毒蛋白的诱导作用下,T-DNA切割、转移并整合至水稻细胞核基因组,实现外源基因的稳定插入与表达。常用农杆菌菌株为EHA105、AGL-1,大豆基因转化,适配水稻愈伤组织侵染体系。
适用受体材料受体为水稻成熟种子诱导的胚性愈伤组织,材料获取不受季节、生育期限制,可全年开展转化实验;其次可选用水稻幼胚、幼穗诱导愈伤,再生能力更强,但取材受限。粳稻愈伤诱导与再生效率显著优于籼稻,籼稻是目前水稻转化的主要难点材料。
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